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使用HPLC时应该注意的一些问题！
分类： 色谱仪资讯
发布时间： 2022-09-30 13:52
高效液相色谱仪是分析实验室常用的检测仪器之一，应用越来越广泛。本仪器在使用过程中，不可避免地会出现各种问题，直接影响测量数据的准确性和仪器的正常运行。如果操作者能够了解故障的原因，他就能够清楚地了解预防和排除这些故障的方法，从而能够正确地使用仪器并充分发挥其性能。今天从以下几个方面给大家分享一下使用HPLC时应该注意的一些问题。
一、使用试管的问题
1、试管的清洁度
高效液相色谱(HPLC)是一种非常灵敏的分析方法。如果使用不干净的试管，测试结果的准确性会受到影响。例如，当使用甲醇作为溶剂来溶解样品时，所使用的小试管覆盖有橡胶塞。因此，每次进样都有一个固定保留时间的干扰峰。经确认，此干扰峰是由胶塞浸泡在甲醇中溶解的成分引起的，更换玻璃试管后干扰峰消除。
2、塑料试管的溶解
近年来，一次性塑料试管给检测者带来了极大的便利。但在使用过程中必须注意试管中有机溶剂的溶解。当用这种试管提取样品时，一些有机溶剂(如氯仿等。)溶解在管壁中，这些溶解物质有时会在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定。这时，可以先用同样的实验条件对其进行测试，看被萃取的溶液在不含被萃取物质的情况下，是否能在检测器上产生干扰信号。如果有干扰信号，只能换成耐有机溶剂的玻璃试管。
3、被测样品在试管壁上的吸附
这个问题也要注意，否则会影响测试结果的准确性。在治疗药物监测(TDM)中，阿米替林、丙咪嗪等一些被测药物容易吸附在玻璃试管壁上。因此，手术中应使用聚丙烯管。为防止萃取过程中吸附的发生，可采用0.5%己二胺溶液作为萃取剂，可有效防止吸附。
二、操作喷射阀的问题
目前，7725进样阀常用于分析型高效液相色谱。其内部六通阀结构使得注射操作非常方便，但如果使用不当，也会带来问题。例如，在高效液相色谱过程中，有时会出现色谱峰异常、重现性差等问题，主要是操作方法不当造成的。解决此类问题，需要从以下几个方面入手。
1、样品体积的控制
进样阀用于进样时，阀内的样环是定量的(一般分析进样阀的样环体积为20ul)。由于注入进样阀的样品溶液在样品环的管道中存在径向速度梯度(即管轴处的液体流速快于管壁处的液体流速)。因此，为了用样品溶液填充样品定量环并使用进样阀进行精确定量，进样量必须大于样品定量环体积的2倍。如果用注射器控制进样量，最大进样量只能是样品环体积的1/2，以免部分样品从溢流管溢出，造成定量分析误差。
2、喷射阀的清洁
如果样品环中有上次进样的样品残留，必然会污染下次进样的样品。为了防止这种现象，应该采取以下步骤:a .喷射阀有两个位置，喷射和装载。首先在进样位置，用注射器将流动相注入进样阀进行多次清洗，用量约为40ul每一次；b .然后手动将进样阀板转到进样位置时，用流动相冲洗几次，剂量仍为40ul每一次；最后，将样品注入进样阀。按照上述步骤，可以避免进样阀带来的污染，从而消除干扰峰，提高分析结果的准确性。
3、喷油阀的溢流管堵塞
有时，进样阀的溢流管堵塞，样品注入进样阀时，注射针头推不动。这次故障是由溢流管堵塞引起的。堵塞大多是溶解样品的流动相中使用的盐溶液造成的，其中的盐在溢流管的排空口结晶。此时，可用小烧杯中的少量蒸馏水稍微浸泡溢流嘴，可溶解端口处的盐结晶，从而排除故障。如果每次注射后可以用蒸馏水反复冲洗溢流管中的盐，就可以避免这种故障。
三、移动阶段(MOBLLE PHASE)
高效液相色谱中常用甲醇和乙腈制备流动相。HPLC常用的试剂最好是高档的专用试剂，比如色谱纯试剂。当要求不太严格时，也可以使用优级纯甚至分析纯试剂。高效液相色谱中常用紫外检测器。因此，为了降低基线噪声，提高分析灵敏度，应使用低紫外吸收、低杂质含量的色谱纯试剂。
1、流动相的过滤
配制好的流动相在使用前必须用0.5um微孔滤膜过滤。这是因为溶液中含有许多肉眼难以发现的微小颗粒。如果不滤出，泵口和柱头上的过滤器就会堵塞，从而堵塞流动相的正常通道，增加色谱柱的阻力，增加柱压，降低柱效。在这种情况下，应改用过滤后的流动相，将堵塞的过滤器取出，浸泡在20%的硝酸水溶液中，用超声波清洗器清洗20分钟，以清除过滤器上的堵塞物。
2、流动相脱气
流动相在使用前必须脱气，以便尽可能多地除去溶解在流动相中的气体，否则这些气体会降低色谱柱填料的性能，并对检测器的信号造成很大的干扰。脱气方法有很多种，如超声波脱气、真空脱气、氮气脱气等。真空脱气和氮气流脱气是目前最常用的脱气方法。当与水和甲醇混合时，会产生大量的气泡。如果不脱气使用，气泡会进入色谱柱和检测器，影响正常分析。
四、色谱柱的使用和维护
色谱柱是高效液相色谱仪最重要的组成部分，色谱柱的性能对被测物质的分离和测定起着决定性的作用。因此，在日常工作中，要特别注意色谱柱的正确使用和维护，以延长色谱柱的使用寿命。
1、使用预柱和保护柱
预柱安装在泵和进样器之间，为色谱柱内的流动相提供完全平衡，防止破坏色谱柱填料的组分或污染物进入色谱柱。保护柱可以阻挡能牢固吸附在色谱柱上的组分进入色谱柱，保护柱应与色谱柱的填料相同。可以经常更换预柱和保护柱，而不是经常更换色谱柱，延长了色谱柱的使用寿命。
2、防止气体进入色谱柱
有些色谱柱(如凝胶柱)是不允许气泡进入的，否则会降低柱效甚至形成难以驱除的微小气室。因此，为了防止气泡进入色谱柱，必须使用脱气的流动相，并严格按照以下步骤安装色谱柱。a .取下下色谱柱入口处的密封螺丝，观察是否有溶剂渗出；b .如果有溶剂渗出，将色谱柱连接到管道上，避免气泡进入；如果没有溶剂渗出，表明空气已经进入色谱柱的这一端。此时可将色谱柱的出口端连接到进样阀上，用流动相反方向冲洗色谱柱，以除去柱内空气。最好用0.2ml/min的小流量冲洗色谱柱。如果溶剂流速过快或压力突然升高，色谱柱的性能会降低。d .如果流动的溶剂中不含气泡，说明柱内气体已经排出，然后将色谱柱连接在正确的方向，使气泡无法进入色谱柱。
3、清洁色谱柱
为了防止被测物质和杂质留在色谱柱内，每次样品分析后都要及时清洗色谱柱。首先，色谱柱要用对被测样品有较强洗脱能力的溶剂进行洗脱。以常用的反相色谱分析方法为例。因为第一个流出物质是极性物质，所以应该使用100%甲醇或极性稍弱的溶剂如异丙基纯和四氢呋喃来洗脱吸附在柱上的极性物质。洗脱剂的量通常是柱体积的20倍。如果流动相是缓冲溶液，则应该用蒸馏水清洗色谱柱以洗去色谱柱中的盐，然后用合适的溶剂清洗。
凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography)中使用的凝胶柱通常使用缓冲溶液作为流动相，使用后必须用蒸馏水清洗。如果是连续操作，缓冲液可以在柱内放置过夜，但最好保持小流量(< < 0.5ml/min)，防止缓冲盐沉淀。如果流动相含有卤化物，即使停止过夜，也必须用蒸馏水将色谱柱清洗干净，以防止卤化物腐蚀色谱柱。
4、色谱柱的储存
如果色谱柱暂时不用，在储存过程中应注意以下几点:
A.几天内短期存放，要用溶剂(如凝胶柱、蒸馏水)冲洗色谱柱，然后用密封螺丝将色谱柱两端密封。
B.如果色谱柱长期不用，只能用上述方法处理不了。此时，色谱柱应充满色谱柱使用说明书中规定的溶剂。反相柱一般用甲醇，正相柱可以用正己烷或庚烷，凝胶柱不能用水。因为微生物在柱内生长会降低柱效，所以要用0.05% NaNs水溶液(防腐剂)冲洗色谱柱，然后将色谱柱密封严密。色谱柱长时间放置时，必须将色谱柱两端密封严密，防止溶剂挥发造成色谱柱填料干燥收缩，严重降低柱效。
C.色谱柱应储存在室温下。如果放在0℃以下的环境中，色谱柱会冻结，也会导致柱效降低。
高效液相色谱(HPLC)的结构一般由高压灌注系统、进样系统、分离系统、记录和检测系统以及数据处理系统组成。制备仪器还应配备馏分收集系统。为了获得更好的分析结果，HPLC仪器对结果的准确度、精密度、灵敏度和重现性有更高的要求。
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常见问题
什么是RoHS？
RoHS是由欧盟立法制定的一项强制性标准，全称是《关于限制在电子电气设备中使用某些有害成分的指令》。该标准已于2006年7月1日开始正式实施，主要用于规范电子电气产品的材料及工艺标准，使之更加有利于人体健康及环境保护。
该标准的目的在于消除电器电子产品中的铅、汞、镉、六价铬、多溴联苯和多溴二苯醚（注意：PBDE正确的中文名称是指多溴二苯醚，多溴联苯醚是错误的说法）共6项物质，并重点规定了镉的含量不能超过0.01%。
最新RoHS指令新增加了邻苯四项检测项目，分别为DEHP：邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，BBP：邻苯二甲酸丁基苄酯，DBP：邻苯二甲酸二丁酯，DIBP：邻苯二甲酸二异丁酯。
ROHS十项有害物质含量限值是多少？
1、镉：小于100ppm。
2、铅：小于1000ppm。
3、汞：小于1000ppm。
4、六价铬：小于1000ppm。
5、多溴联苯PBB：小于1000ppm。
6、多溴联笨醚PBD：小于1000ppm。
7、邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）：小于1000ppm。
8、邻苯二甲酸丁苄酯（BBP）：小于1000ppm。
9、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）：小于1000ppm。
10、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）：小于1000ppm。
RoHS检测一般使用什么仪器？
用于RoHS1.0常用的检测仪器是X射线荧光光谱（XRF）。XRF分析仪有独立式、台式和手持式两种形式。通常首先使用手持式XRF分析仪进行便携式现场XRF测试，并专注于产品中含有受限物质风险较高的部分。
随着RoHS2.0出现，规定四种添加邻苯二甲酸酯也在rohs指令中，需要进行额外的测试以确定这些化合物的水平，这些化合物是用溶剂提取的。然后使用气相色谱结合质谱（GC/MS）或结合火焰电离检测（GC/FID）分析提取溶剂是否存在邻苯二甲酸盐。其它元素和多溴二苯醚/丙烯基弹性体分别由比较方案和GCMS进行分析。
RoHS十项需要两台仪器来检测吗？
RoHS十项需要两台仪器来检测。
对于RoHS十项检测来说必须要有两台仪器才能完成。单纯一台仪器是不可能实现的。即使用一台仪器测试重金属元素含量，另外一台测试化合物。
X荧光光谱仪来检测rohs1.0，而色谱仪或者是热裂解仪或质谱联用仪来检测rohs2.0项目中的邻苯四项，目前没有任何一台仪器能够单独检测rohs2.0项目。
ROHS检测仪器能否测试金属元素？
ROHS检测仪器，是一种用于检测电子元器件、家电、玩具等产品中是否含有有害物质的专业设备。这些有害物质可能会对人类和环境造成长期的威胁，因此ROHS检测仪器的应用具有极其重要的意义。
对于ROHS检测仪器能否测试金属元素这一问题，答案是肯定的。因为ROHS检测的范围不仅包括有害物质，同时也包括了合格产品中的金属元素成分的检测。这些金属元素包括铅、镉、汞等，这些元素在产品制造环节中被广泛使用。虽然这些元素是有必要的，但过多的使用对人体健康和环境保护都造成极大的危害。因此，ROHS检测仪器的出现为我们检测金属元素带来了很大的方便。
